七百六十五.隱蔽、狡猾、善變

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放療(RT)是肺癌必不可少的治療方式。對於不適合手術的IIIA和IIIB期肺癌患者，根治性放化療是治療標準，這一點已被廣泛接受。不幸的是，放療后腫瘤的再生長是成功控制疾病的主要障礙。

臨床前研究表明，放療對原發部位和轉移部位的腫瘤免疫微環境具有雙重作用。一方面，局部照射有可能激活針對遠離照射區域的腫瘤細胞的全身免疫反應，即遠隔效應，由Mole在1953年首次報道。RT促進腫瘤抗原從垂死的腫瘤細胞中釋放，上調MHCI類表達，並增加多種細胞因子和免疫效應分子的表達，包括白細胞介素(IL)-1、細胞間粘附分子1(ICAM1)和血管細胞粘附分子1(VCAM1)，所有這些都有助於由輻射引發的持久和全身抗腫瘤免疫。另一方面，放療促進了腫瘤細胞的免疫逃避。例如，RT上調多種免疫抑制細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-10和轉化生長因子-β(TGF-β)。RT促進免疫抑制細胞的積累，例如腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、調節性T(Treg)細胞和髓源性抑制細胞(MDSC)。輻射增強免疫檢查點的活性，如程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)/PD-L1、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4()、T細胞免疫球蛋白和含粘蛋白結構域的蛋白3(TIM3)，和淋巴細胞激活基因3(LAG3)。

為了克服放療的免疫抑制作用，已經提出並測試了免疫療法和放療的各種組合。在PACIFIC研究中，標準放化療后加入durvalumab可延長III期NSCLC患者的無進展生存期和總生存期。PACIFIC研究的巨大成功不僅改變了III期非小細胞肺癌的臨床指南，也引起了其他免疫療法與RT結合的極大興趣。

MDSCs的積累和激活在免疫抑制的建立中起關鍵作用。RT對MDSCs的確切影響是複雜的。大分割照射(20Gy)抑制MDSCs的積累和浸潤，而較低劑量的照射往往會促進MDSCs募集到腫瘤中。此外，臨床前和臨床研究表明，胃腸道腫瘤，包括結直腸癌和肝癌，在放療后相對容易出現MDSCs水平降低，而在其他腫瘤模型和臨床環境中，如膠質瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、前列腺癌和宮頸癌，導致MDSC數量持續增加。蔡等人首次報道MDSCs的PD-L1表達被輻照上調。然而，關於MDSCs的確切作用，尤其是其潛在機制，在輻照后塑造TME方面知之甚少。

MDSCs是一組具有強大免疫抑制能力的異質髓細胞。根據表型和形態，MDSCs又可分為多形核MDSCs(PMN-MDSCs，又稱粒細胞型MDSCs)和單核型MDSCs(M-MDSCs)。

免疫抑制活性是MDSCs的關鍵標誌。MDSCs的抑制機制包括誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(ARG1)和吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)的表達，以及一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的產生。這些不同的機制不會同時起作用。人們普遍認為PMN-MDSCs和M-MDSCs通過不同的機制調控TME。此外，PD-L1的上調也被認為是輻射招募MDSCs的免疫抑制機制之一。目前，對於輻照誘導的MDSCs對TME的影響及放療的治療效果尚無一致的結論。

磷酸二酯酶-5(PDE5)抑製劑，如西地那非和他達拉非，可以阻斷環磷酸鳥苷(cGMP)的水解。最新數據表明，PDE5抑製劑能夠通過抑制荷瘤(TB)小鼠和患者MDSC中iNOS和ARG1的活性和表達來促進抗腫瘤免疫。然而，PDE5抑製劑如何影響MDSC的亞群以及RT和PDE5抑製劑的組合是否會延遲輻射后的腫瘤再生尚未得到測試。

我們最近的研究表明，消除招募的MDSC會延遲放療後路易斯肺癌(LLC)的再生。在這裏，我們報告了局部照射通過促進PMN-MDSC的增殖及其隨後向TME的募集而削弱了抗腫瘤免疫力。ARG1的上調和激活是照射后PMN-MDSCs介導的T細胞抑制的主要機制。西地那非與放療的組合通過抑制ARG1過表達和PMN-MDSC募集消除了輻射衍生的免疫抑制。

在TB小鼠和癌症患者中，MDSCs隨着腫瘤的生長而擴增。MDSCs的兩個亞群之間的比例取決於特定的腫瘤模型和微環境。為了監測同源LLC模型中MDSC的丰度，我們通過免疫表型分析確定了接種后腫瘤的生長以及LLC小鼠中不同時間點的總體MDSC及其亞群。

如圖1C所示，腫瘤組織中總MDSCs的百分比隨着腫瘤的發展而穩步增加，從接種后第一周腫瘤浸潤淋巴細胞的不到10%（5.84±1.22%）上升到第四周超過20%（21.71±3.22%）（P<0.01）。在我們的LLC模型中，PMN-MDSCs佔總MDSCs的94.94±8.47%，並且與總MDSCs具有相同的腫瘤發展趨勢（P<0.05）。對亞群進行分析，雖然M-MDSCs增加了大約5倍，但差異沒有統計學意義。

為了更好地了解MDSCs的全身分佈，我們還研究了MDSCs在外周血、脾臟和骨髓中的比例。僅在接種LLC細胞一周后，TB小鼠外周血中的MDSC百分比是無瘤小鼠的兩倍(27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，P<0.05)，3周后的MDSC百分比是無瘤小鼠的5倍(27.33±4.62%vs.12.48±0.93%，P<0.05)。TB小鼠外周血中PMN-MDSCs的比例也增加，而M-MDSCs的比例與腫瘤大小無關。

PD-L1是腫瘤細胞、MDSCs、巨噬細胞和樹突狀細胞表達的最重要的檢查點分子之一。為了確定TB小鼠MDSCs的PD-L1表達是否與健康小鼠不同，我們通過流式細胞術測試了MDSCs的PD-L1表達。結果表明，TME中MDSCs上PD-L1的平均熒光強度（MFI）從在LLC細胞接種后的第一周386.8±100.9a.u逐漸增加到第四周的1，068.0±121.8a.u（P<0.01），這表明PD-L1在我們模型中的MDSC中具有潛在作用。

在脾臟和骨髓中，隨着腫瘤的發展，MDSCs的比例也顯著增加，其模式與腫瘤組織和外周血中的MDSCs相同。此外，我們在TB小鼠中觀察到明顯的脾腫大，這與我們觀察到的MDSCs在脾內聚集一致。

為了確定局部照射對腫瘤生長和MDSCs的影響，當腫瘤直徑達到7.5mm時，我們使用大分割RT(20Gy/F)治療皮下LLC腫瘤。放療導致腫瘤進展延遲長達一周，在第7至第10天的最小體積約為500mm3，但此後腫瘤開始再生。根據放療前後腫瘤生長曲線，我們選擇放療后第3天為再生前生長，放療后1周為腫瘤體積最小時為再生開始，放療后2周和3周為再生階段。腫瘤組織蘇木精-伊紅染色顯示，與未治療的腫瘤相比，放療后的腫瘤中有更多的浸潤性炎症細胞。隨後的CD11b特異性免疫組化染色顯示，大多數炎症細胞是CD11b+髓系細胞，這表明局部照射可能導致MDSCs的積累。為了證實我們的假設，我們在局部照射后的不同時間點對總MDSCs和這兩個亞群進行了流式細胞術分析。局部照射后，放療后腫瘤浸潤MDSCs的比例比未治療腫瘤高2倍(ctrlvs.RT=21.33±3.29%vs.44.10±3.00%，P<0.001)。PMN-MDSCs與總MDSCs具有相同的增加趨勢(ctrlvs.RT=16.37±2.47%vs.38.66±4.24%，P<0.001)，而M-MDSC比例保持在約0.1%，且與腫瘤大小和治療無關。外周血情況同腫瘤組織。

為了確定受照射腫瘤中PMN-MDSC的逐漸積累是否有助於LLC腫瘤的再生長，或者這種積累是否僅僅是腫瘤生長的結果，使用抗Ly-6G單克隆抗體來消耗MDSC.抗Ly-6G抗體的應用顯着降低了腫瘤部位和外周血中PMN-MDSC的頻率（P<0.05）。此外，用抗Ly-6G抗體治療大大延遲了照射后的再生，這表明PMN-MDSC的募集對腫瘤再生至關重要。

雖然PMN-MDSCs利用一系列機制來抑制抗腫瘤免疫反應，這涉及到許多免疫細胞和細胞因子，但對CD8+T細胞的抑制無疑是最重要的。為了確定RT后PMN-MDSCs誘導的免疫抑制是否依賴於CD8+T細胞，我們通過流式細胞術評估了CD8+T細胞的數量和功能。

如圖3D所示，CD8+T細胞的百分比隨着照射從11.71±2.31%下降到2.42±0.62%(P<0.01)。PMN-MDSC耗竭逆轉了這種下降（RT+anti-Ly-6G抗體=2.42±0.62%vs.20.12±3.92%，P<0.01）。為了更好地了解CD8+T細胞浸潤腫瘤部位的功能狀態，我們測量了CD8+T細胞內部和表面上IFN-γ、CD28和PD-1的表達。局部RT顯着降低了CD8+T細胞分泌IFN-γ的比例，從33.064.53%降至13.252.08%，並增加了表達PD-1的CD8+T細胞的比例（ctrlvs.RT=253.20±57.03auvs.538.80±98.76）au，P<0.05）。

CD28表達未觀察到顯着變化。當抗Ly-6G抗體被給予輻照小鼠時，IFN-γ分泌達到與未處理的LLC小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而與輻照小鼠進行比較抗Ly-6G抗體處理后的PD-1表達沒有變化小鼠。因此，在這部分我們建議PMN-MDSCs通過抑制CD8+T細胞促進放療后腫瘤的再生。PMN-MDSCs不僅抑制了TME中CD8+T細胞的數量，而且還抑制了其活性。

為了確定輻照誘導MDSCs的抑制機制，我們進行了免疫組化染色及iNOS和ARG1活性檢測。腫瘤切片的免疫組化染色顯示，局部RT增強了ARG1的表達，但沒有增強iNOS的表達。ARG1活性測定表明，局部照射顯著提高了ARG1的活性，從0.400.15U/L提高到3.780.39U/L((P<0.01)。相比之下，NO熒光標記的iNOS活性檢測顯示，輻照和未處理的腫瘤組織樣本的熒光強度相似。

PD-L1的表達是MDSCs的一種新型免疫抑制機制。然後我們詢問PD-L1上調是否是RT后MDSCs介導的免疫抑制的機制之一。通過流式細胞術分析輻照后MDSC中PD-L1的表達。圖4E顯示，與未處理組相比，受照射腫瘤的MDSC中的PD-L1表達在照射后不久顯着增加（照射后第三天：ctrlvs.RT=443.9±175.3auvs.1328.0±324.3au，P<0.05）.然而，此後PD-L1表達繼續下降，局部照射組在照射后第3周顯着低於未治療組（ctrlvs.RT=1，465.0±399.6auvs.407.5±164.8au，P<0.05）。外周血中MDSCs的PD-L1表達與局部腫瘤部位的表達趨勢相同。

以上數據表明ARG1表達的上調是照射后PMN-MDSCs抑制功能的合理機制。然而，不涉及PD-L1和iNOS的調節。為了進一步證實這一假設，在輻射后通過灌胃給予ARG1抑製劑nor-NOHA。10mg/kg/dnor-NOHA有效地將ARG1活性從3.780.39U/L降低到2.020.25U/L（P<0.01）。

RT后給予nor-NOHA顯着增加CD8+T細胞比例（RTvs.RT+nor-NOHA=2.420.62%vs.6.140.64，P<0.01），並伴有腫瘤再生延遲。iNOS抑製劑1400W對腫瘤再生長沒有影響。

我們的結果表明，RT通過上調腫瘤內PMN-MDSC的百分比和ARG1活性來促進腫瘤免疫逃避。推測抑制PMN-MDSCs及其ARG1活性可能是一種新的抗腫瘤策略是合理的。越來越多的證據表明，PDE5抑製劑可以抑制TB小鼠和癌症患者MDSC中iNOS和ARG1的活性和表達。因此，通過灌胃給予西地那非20mg/kg/d，以研究它是否可以促進RT的抗腫瘤作用並闡明潛在機制。如圖5B所示，正如我們預期的那樣，西地那非延遲了照射后的腫瘤再生長，這與陽性對照Nor-NOHA相當。TME的免疫特徵表明，當給予西地那非時，腫瘤內PMN-MDSC的比例從38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。

此外，西地那非也顯着降低了ARG1的表達。為了進一步檢查西地那非對MDSC的抑制是否真的導致抗腫瘤免疫增強，我們分析了腫瘤內CD8+T細胞的比例和活性。流式細胞術分析表明CD8+T細胞的百分比從2.42±0.62%增加到7.21±1.22%。

此外，當給予西地那非時，CD8+T細胞分泌的IFN-γ也顯着升高。因此，我們證實PDE5抑製劑西地那非通過調節PMN-MDSCs改善了照射后腫瘤免疫微環境。西地那非聯合放療可能是提高放療療效的一種有前景的策略。

工作揭示了PMN-MDSCs中ARG1通路介導RT后腫瘤再生的新機制，如圖6所示。我們認為，PMN-MDSCs是輻照招募的主要亞型，而不是M-MDSCs。在廣泛的免疫抑制機制中，ARG1的上調和激活是PMN-MDSCs在放療后抑制CD8+T細胞的主要機制。為了克服PMN-MDSCs引起的免疫抑制，我們提出並證明，sildenafil和RT聯合使用降低了PMN-MDSCs在TME內的募集和免疫抑制作用，激活了CD8+T細胞應答，導致腫瘤生長延遲。綜上所述，我們的研究結果為緩解免疫抑制TME以提高RT治療效果提供了一種新的解決方案。雖然所有這些結果都是在LLC小鼠模型中進行的，但同樣的機制是否適用於其他腫瘤模型尚不清楚。此外，在不同的輻射方案下，MDSCs及其亞型如何影響TME仍未確定。因此，這些問題還需要進一步的研究來解決。