第770章 770.變異
令人信服的證據支持炎症成分參與癌症發展的不同階段，包括癌變、癌症侵襲和轉移。然而，在流行病學和實驗研究中，以嗜酸性粒細胞顯着浸潤到炎症部位為特徵的過敏原誘導的氣道炎症與癌症風險呈負相關。嗜酸性粒細胞浸潤在臨床的各種實體瘤中也經常觀察到，並且在大多數研究中通常與良好的預后相關，表明嗜酸性粒細胞具有潛在的抗腫瘤作用。這引發了大量研究，以解決所涉及的潛在機制。幾項研究已經證明了體內和體外嗜酸性粒細胞的抗腫瘤功能並強調了各種機制，概括為(i)細胞毒性顆粒和酶的脫顆粒以直接殺死腫瘤細胞，以及(ii)產生廣泛的免疫活性因子來調節腫瘤環境。然而，關於嗜酸性粒細胞對腫瘤轉移的直接影響的信息很少。
腫瘤微環境中的嗜酸性炎症也可能導致轉移。嗜酸性粒細胞相關細胞因子，如白細胞介素-5(IL-5)，是影響過敏性炎症中嗜酸性粒細胞分化和存活的關鍵因素。雖然混雜因素使嗜酸性炎症和腫瘤之間的關係複雜化，但已有文獻表明IL-5通過嗜酸性粒細胞形成肺的轉移性定植。據報道，嗜酸性過氧化物酶(EPX)在4T1乳腺癌模型中促進腫瘤轉移。通過組織染色，EPX也被認為是預測原發性肺腺癌患者臨床結局的潛在生物標誌物。這些研究表明，嗜酸性粒細胞及其介質在癌症轉移中的作用可能比之前所了解的要大得多。因此，應該重新考慮嗜酸性粒細胞的抗腫瘤作用，直到有更多的證據說明嗜酸性粒細胞在癌症轉移中的作用機制。
以前報道，C-C趨化因子配體6(CCL6)是一種主要由單核細胞或巨噬細胞中產生的趨化因子，過度表達CCL6可以加速腫瘤生長，並增加小鼠腫瘤局部和轉移擴散。CCL6與人C-C趨化因子MPIF-1CCL23具有同源性，MPIF-1CCL23在腫瘤組織中顯著上調。CCL23的高表達與癌症患者的加速進展和短生存期相關。前期研究表明CCL6CCL23結合併激活C-C趨化因子受體1(CCR1)，表達於多種免疫細胞和腫瘤細胞表面，促進腫瘤轉移。在這裏，我們假設CCL6-CCR1信號通路參與了嗜酸性粒細胞相關的腫瘤轉移。因此，我們研究了嗜酸性粒細胞在炎症作用下對實驗性腫瘤細胞轉移的作用，發現嗜酸性粒細胞促進了CCL6依賴的轉移性腫瘤的生長。
研究結果
1.卵清蛋白誘導的氣道炎症和葡聚糖硫酸鈉誘導的結腸炎症促進小鼠轉移
為了確定伴有嗜酸性粒細胞增多的炎症對腫瘤轉移的影響，我們首先在我們首先建立了C57BL6野生型(WT)小鼠典型卵清蛋白(OVA)誘導哮喘模型后的黑色素瘤肺轉移模型。我們觀察到與對照小鼠相比，氣道炎症小鼠的肺轉移顯着增。
然後建立實驗性葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎模型，然後將腫瘤細胞注射到腹腔中。此外，DSS誘導的結腸炎症導致結腸轉移的加重表型。
隨後探索緩解炎症以防止轉移的作用。廣譜抗炎葯地塞米松(DEX)可有效抑制氣道炎症以減少肺轉移。
為了確認嗜酸性粒細胞增多，我們對OVA模型中的肺組織和DSS模型中的結腸進行了免疫組織化學和流式細胞術分析。結果確定了氣道炎症中的嗜酸性粒細胞浸潤。
DSS誘導的結腸炎表現為結腸黏膜中大量白細胞浸潤，包括嗜酸性粒細胞。
嗜酸性粒細胞缺乏小鼠減弱了OVA刺激后的肺轉移，而在DSS治療后它們對結腸轉移沒有影響。這與嗜酸性粒細胞缺乏消除OVA誘導的氣道炎症但未能緩解DSS誘導的結腸炎的證據一致
2.嗜酸性粒細胞增多對於Cd3δ-Il-5轉基因小鼠骨轉移增加是必不可少的
接下來，為了研究持續性嗜酸性粒細胞增多對體內轉移的長期影響，我們利用了Cd3δ-Il-5轉基因(Il-5Tg)小鼠，如圖2A所示骨髓中產生了非常高水平的嗜酸性粒細胞，並維持在外周血中。通過尾動脈注射腫瘤細胞將腫瘤細胞輸送到髂總動脈下游的器官，主要在下脊柱和後肢中高頻發生骨轉移。與WT小鼠中較少的脊柱轉移相反，我們在Il-5Tg小鼠中觀察到更多可見的色素性脊柱病變。
據報道，腫瘤細胞的尾靜脈注射很少導致骨轉移。然而，除了更多的脊柱轉移數量外，Il-5Tg小鼠的轉移風險顯着更高。在脛骨和股骨中也證實了類似的結果。股骨的組織學檢查顯示Il-5Tg小鼠的早期定植和明顯的腫瘤病灶。
鑒於IL-5已被證明通過調節多種宿主細胞來支持轉移，包括嗜酸性粒細胞、調節性T細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞和中性粒細胞，我們接下來確定了骨轉移增加和嗜酸性粒細胞的聯繫。為此，我們將Il-5Tg小鼠與Eos-null小鼠交叉以消除嗜酸性粒細胞。然後，我們用WT、Il-5Tg、Il-5Tg和Eos-null小鼠的BM重建輻照WT小鼠，以排除BM基質細胞對骨轉移的貢獻。注射腫瘤細胞后，接受來自Il-5Tg和Eos-null供體的BM的嵌合小鼠沒有表現出轉移數量和腫瘤負荷的增加。這些結果證實嗜酸性粒細胞增多對於增加Il-5Tg小鼠的骨轉移是必不可少的。
3.嗜酸性粒細胞直接支持腫瘤細胞遷移和轉移形成
鑒於觀察到Il-5Tg小鼠早期骨轉移增強，我們研究了嗜酸性粒細胞是否能直接促進腫瘤細胞的生存和生長。我們研究了嗜酸性粒細胞是否可以直接促進腫瘤細胞的存活和生長。通過進行體外實驗，在不存在嗜酸性粒細或存在嗜酸性粒細胞的情況下培養腫瘤細胞，我們發現腫瘤細胞的克隆活性沒有明顯改變。考慮到嗜酸性粒細胞可能會誘導腫瘤細胞凋亡和壞死，我們評估了與嗜酸性粒細胞共培養的腫瘤細胞的存活率。沒有發現嗜酸性粒細胞對腫瘤細胞死亡的顯着影響。類似的發現表明，有或沒有嗜酸性粒細胞，EdU陽性增殖腫瘤細胞的比例沒有明顯差異，腫瘤細胞的細胞周期也沒有變化。這些結果表明嗜酸性粒細胞對改變腫瘤細胞生長沒有實質性影響。
隨後，我們在體外進行了遷移實驗。在培養過程中，與嗜酸性粒細胞直接或間接接觸后，腫瘤細胞的遷移能力顯著增強，提示嗜酸性粒細胞以接觸無關的方式促進腫瘤細胞的遷移。用來從Il-5Tg小鼠和對照小鼠的BM上清液進行遷移試驗，研究結果表明，嗜酸性粒細胞來源的因子可能促進腫瘤細胞遷移。
我們將腫瘤細胞與嗜酸性粒細胞混合，然後將混合物靜脈內共注射到WT小鼠中，與單獨注射腫瘤細胞相比，這導致肺轉移增加。在平行實驗中，嗜酸性粒細胞在腫瘤細胞靜脈注射后立即被過繼轉移（氣管內），這導致了類似的結果。
接下來我們研究了嗜酸性粒細胞與癌症患者轉移之間的關係。與非癌症患者的胸腔積液相比，胸膜轉移患者的惡性胸腔積液(MPE)檢測到更多的嗜酸性粒細胞(圖4，A和B)，其他免疫細胞包括巨噬細胞、淋巴細胞和中性粒細胞沒有變化。
4.CCL6在嗜酸性粒細胞誘導的腫瘤細胞遷移和嗜酸性粒細胞依賴的轉移形成中至關重要
我們的目的是確定嗜酸性粒細胞促進腫瘤細胞遷移和轉移形成的有效因素。既往研究報道CCL2、CCL3、CCL5、CCL6、CCL8、CXCL12、CXCL14等細胞因子和趨化因子直接或間接靶向腫瘤細胞促進轉移。我們採用實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)從Il-5Tg小鼠和WT小鼠的BM細胞中篩選一組細胞因子和趨化因子。CCL6是Il-5Tg小鼠中最豐富的細胞因。由於CCL23已被確定為小鼠CCL6的人類同源基因，我們隨後評估了人類樣本中的CCL23水平，並發現相對於非癌症患者的胸腔積液，MPE中CCL23濃度增加(圖4D)。此外，CCL6的高分泌主要在嗜酸性粒細胞中發現(圖4E)。為了確定嗜酸性粒細胞衍生的CCL6是否參與腫瘤細胞遷移和轉移，我們產生了Ccl6敲除小鼠（Ccl6）並將它們與Il-5Tg小鼠（Il-5Tg和Ccl6）雜交。相對於Il-5Tg小鼠，Il-5Tg和Ccl6小鼠的嗜酸性粒細胞的基礎數量沒有差異。分離來自Il-5Tg小鼠的Eos和來自Il-5Tg和Ccl6小鼠的EosCcl6兩種類型的嗜酸性粒細胞以進行體外遷移測定，值得注意的是，向EosCcl6遷移的腫瘤細胞的數量減少了。
嗜酸性粒細胞或CCL6缺失不影響體內基線肺轉移(圖S10，C和D)，而嗜酸性粒細胞CCL6缺失顯著減少嗜酸性粒細胞依賴性肺轉移。與Il-5Tg小鼠相比，Il-5Tg和Ccl6小鼠通過尾動脈注射腫瘤細胞后骨轉移也少得多。此外，靜脈注射腫瘤細胞后，在CCL6缺乏的Il-5Tg小鼠中，骨轉移數的增加和腫瘤負荷均有所降低。總之，這些觀察結果表明CCL6在體內對嗜酸性粒細胞誘導的腫瘤細胞遷移和嗜酸性粒細胞依賴的轉移形成至關重要。
5.抑制CCL6受體CCR1可減輕腫瘤細胞遷移和轉移的形成
據報道，CCR1是一種推定的CCL6受體。我們探討了嗜酸性粒細胞衍生的CCL6是否可以通過CCR1將腫瘤細胞募集到轉移部位。我們通過shRNA穩定敲除B16-F10細胞中的CCR1，慢病毒非靶向shRNA作為對照。CCR1缺陷的B16-F10（shCCR1B16-F10）細胞向嗜酸性粒細胞或嗜酸性粒細胞培養上清液的遷移顯着減少。CCR1缺陷的B16-F10細胞在Il-5Tg小鼠中也顯示出較少的骨轉移，在OVA攻擊的小鼠中顯示出較少的肺轉移。這些結果證明，CCR1在腫瘤細胞中的表達對於嗜酸性粒細胞誘導的腫瘤細胞遷移和轉移形成至關重要。
我們通過使用CCR1特異性抑製劑BX471進一步檢測了CCR1抑制對腫瘤細胞的影響。BX471顯着減弱了體外嗜酸性粒細胞上清液誘導的B16-F10細胞的遷移。BX471處理的腫瘤細胞在體內發生的骨轉移明顯減少。由於嗜酸性粒細胞中的CCL6缺失或CCR1在腫瘤細胞中的抑制足以緩解嗜酸性粒細胞誘導的腫瘤細胞遷移和轉移形成，因此CCL6-CCR1信號傳導可能是預防嗜酸性粒細胞依賴性腫瘤轉移的有價值的治療策略。
研究結論
證據表明炎症成分有助於癌症的發展。然而，涉及幾種炎症性疾病的嗜酸性粒細胞在癌症轉移中並未得到充分探索。我們發現氣道炎性嗜酸性粒細胞增多和伴有嗜酸性粒細胞浸潤的結腸炎症都與小鼠轉移增加有關。嗜酸性粒細胞增多是富含嗜酸性粒細胞的Cd3-Il-5轉基因(Il-5Tg)小鼠骨轉移增加的原因。我們還觀察到有胸膜轉移的癌症患者的惡性胸腔積液中嗜酸性粒細胞增多。從機制上講，嗜酸性粒細胞通過分泌CCL6促進腫瘤細胞遷移和轉移形成。在Il-5Tg小鼠中Ccl6的基因敲除顯着減弱了骨轉移。此外，抑制腫瘤細胞中的CCR1（CCL6的受體）可減少腫瘤細胞的遷移和轉移。因此，我們的研究確定了嗜酸性粒細胞的CCL6依賴性促轉移活性，它可以通過靶向CCR1來抑制，並代表了一種預防轉移性疾病的方法。在目前的研究結果和上述討論的基礎上，應更加關注評估癌症患者轉移相關的組織嗜酸性粒細胞增多。在這裏，我們預測通過嗜酸性粒細胞浸潤直接靶向炎症或阻斷嗜酸性粒細胞相關趨化因子途徑可以在癌症患者中獲得臨床益處。我們也呼籲警惕腫瘤患者嗜酸性粒細胞增多引起的轉移風險和不良預后。我們已經確定了以前未知的嗜酸性粒細胞在支持腫瘤細胞募集方面的CCL6依賴性促轉移活性，它可以被CCR1抑製劑靶向，並且可能代表一種預防轉移性疾病的方法。
研究優點
應用多種小鼠模型及人類樣本進行相互驗證，實驗設計嚴謹，工作量較大。
借鑒：尾靜脈注射以後可改為尾動脈注射，更易促轉移。
研究缺點
靜脈或氣管注入腫瘤細胞后，檢測胸腔積液中其他類型免疫細胞沒有變化，進一步實驗分析轉移腫瘤內各免疫細胞的變化是否有差異。
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