七百七十四.敵人的敵人就是朋友

對59例EGFR突變的晚期NSCLC患者的腫瘤活檢標本進行了檢測，這些患者以前在1G/2GTKI上經歷過PD。在38例(63%)患者中檢測到EGFRT790M。1G/2GTKI的中位TTP為10.3個月(範圍為1.3-75.8個月)，T790M?組和T790M+組分別為7.4月和13.6個月(HR，1.64;95%CI，0.95-2.83;P=0.07;補充圖S5)。在T790M+和T790M?組之間，之前接受治療的情況沒有差異，包括作為最後線治療的EGFRTKI(65.8%vs.61.9%，P=0.76)、以前使用過化療(76%vs.66%，P=0.75，檢驗)，或化療暴露的持續時間(平均215天vs.175天，P=0.75)。與以前的報告一致，顯微鏡下的組織學轉化是罕見的，一例鱗狀轉化(A450)和另一例混合腺癌小細胞組織學(A092)在基線和耐葯后都觀察到了。

T790M+和T790M?疾病狀態的基因組圖譜

我們首先評估了我們隊列中的體細胞基因組改變（除EGFRT790M外）與38例晚期EGFR突變非小細胞肺癌患者的治療初期隊列（WES數據）的患病率差異。TP53SNV改變在TKI耐葯人群（63%）中比治療初期人群（45%）更為普遍。此外，我們檢測到與治療初期腫瘤相比，治療耐葯腫瘤中TERT和編碼於14q22的三個基因（PTGDR、SAV1和SOS2）的基因組擴增率總體較低。接下來，通過比較T790M+和T790M?，我們試圖確定先前報道的並確定潛在的新的治療可處理耐葯機制?抗TKI的樣品。5例（8%）患者出現MET改變，主要發生在T790M?患者隊列。在一名患者（A056）中，檢測到導致MET外顯子14跳躍（METex14）的剪接位點缺失，外顯子14處的轉錄缺失通過RNAseq數據驗證。該患者還表現出染色體臂7p缺失（EGFR突變缺失）和12q擴增（包含MDM2和CDK4，通常用METex14擴增）。同樣，我們沒有在另一名T790M?患者中檢測到原發性外顯子19缺失/L858R突變（A058），表明失去激活EGFR突變是獲得性耐葯真正罕見的機制。PIK3CA突變（n=10，17%）和HER2擴增（n=4，7%）是常見的，但基於T790M狀態沒有差異（分別為P=0.69和P=0.54），儘管耐葯腫瘤中PIK3CA改變的頻率（17%）總體上高於晚期治療未經EGFR突變腫瘤的患者（5%，P=0.09）。在PIK3CA突變中，值得注意的是，大多數是克隆的（n=5/7），並且由ClinVar註釋為可能致病的（n=6/7）綜上所述，這表明PI3K信號在介導TKI抵抗中的作用獨立於T790M狀態。鑒於KEAP1和NFE2L2共突變在產生治療抵抗中的潛在作用。然而，我們沒有在隊列中檢測到任何NFE2L2突變，我們只在T790M+腫瘤（A449）中檢測到一個KEAP1突變。

TP53改變是在大約一半的EGFR突變的腫瘤中發現的早期克隆事件。與T790M+患者相比，T790M?患者TP53基因突變顯著豐富(86%vs.50%，

P=0.01)，其中大部分(n=36/37，97%)為早期克隆事件(n=36/37，97%)，與T790M+患者相比差異有顯著性(P=0.01)。此外，MDM2和YEATS4擴增在T790M+患者中更為常見，且與TP53突變互斥(P=0.004)。這兩個基因位於同一染色體位置，負調控TP53。正如我們和其他人以前報道的，已知的癌症驅動基因突變的數量越多，多變量分析的Ttp越短(HR，1.41；95%CI，1.09-1.81；P=0.008；補充圖S8A)。特別是，併發的RB1/TP53改變(n=5)與T790M狀態無關的TTP密切相關，與最近的一份報告一致。

拷貝數分析發現，WGD是常見的，與治療初期EGFR突變腫瘤中觀察到的比率(88%vs.89%)相當。然而，在7名(12%)沒有WGD的患者中，所有人都是T790M+(嵌入圖像測試，P=0.04)，並且有EGFR外顯子19的缺失，這表明WGD的缺失預示着T790M+耐葯疾病的出現。在T790M+和T790M?腫瘤之間，基因組不穩定指數(Gii；中位數分別為52%和55%)沒有差異，也沒

有發現TP53共突變與Gii增加相關。T790M?患者的腫瘤突變負荷高於T790M+患者(TMB中位數為2.36vs.1.66個突變/Mb，P=0.02，圖1C；補充圖1C、S9A)，可能是由於T790M?隊列中的吸煙者數量較多

接下來，我們檢查了T790M?患者3q23(包含PIK3CB、MRAS和FOXL2等基因)和T790M+患者14q21(包含FOXA1和NKX2-1)與T790M狀態揭示擴增相關的反覆焦點擴增和缺失事件(補充圖S10)。值得注意的是，3QARM擴增在T790M?組(57%)高於T790M+組(13%)，並且是唯一有統計學意義的ARM水平事件(圖1E，EmbeddedImage-TESTP≤0.001)。我們證實了染色體3Q基因(包括SOX2)在3Q臂增加的患者中有較高的表達(補充圖S11C)。為了了解TKI治療后這些染色體水平改變可能獲得的程度，我們再次與治療前的隊列進行了比較。在治療-初始隊列中，38例中有7例(18%)出現了3Q增加(補充圖S3)腫瘤。這一結果明顯低於T790M?(P=0.003)，但與T790M+患者相似(P=0.53)，提示3Q擴增可能是T790M?腫瘤特異獲得的。有趣的是，染色體3Q含有鱗狀細胞系轉錄因子TP63和SOX2，是肺鱗狀細胞癌的主要特徵，但以前與肺腺癌無關。

接下來，我們研究了與EGFRTKI耐葯相關的突變過程。在肺腺癌中發現了公認的突變特徵，即衰老、APOBEC、DNA雙鏈斷裂修復、吸煙和DNA錯配修復。與T790M?相比，EGFRT790M耐葯腫瘤對衰老信號的相對貢獻率更高，這與EGFRT790M點突變的三核苷酸背景下AG的最高概率核苷酸變化一致(補充圖3S12和S13)。相反，與T790M+腫瘤相比，非衰老特徵(吸煙、載脂蛋白BEC和DNA修復)在T790M?中的比例顯著高於T790M+腫瘤，暗示了驅動T790M?抗性的另一種突變過程。總體而言，這表明T790M耐藥性可能不太可能出現在具有較大比例的活躍的非衰老突變特徵(例如吸煙/APOBEC特徵)的腫瘤中。

我們使用WES數據估計了每個腫瘤樣本的癌細胞比例(純度)，並使用轉錄組去卷積方法Tumera估計和比較了T790M+和T790M?腫瘤中癌症和間質(非惡性)細胞中的基因表達。值得注意的是，我們推測在T790M?腫瘤的癌細胞中，肺腺癌標誌基因如NAPSA、NKX2-1、SFTA2和SFTA3的表達普遍且幾乎完全喪失。此外，我們觀察到鱗狀細胞癌或神經內分泌癌的組織學標誌基因在一小部分T790M?腫瘤中的表達增加(n=4，27%。這些發現得到了多重免疫熒光的正交驗證，證實了與T790M+腫瘤相比，T790M?癌細胞中NAPSA和NKX2-1(TTF-1)的表達降低(圖2D；補充圖S14)。值得注意的是，對三個未接受治療的NSCLC腺癌隊列的分析表明，低腺癌標誌物基因(NAPSA和NKX2-1)的表達非常罕見，僅在EGFR野生型腫瘤中觀察到(圖2F)。總而言之，這些數據突顯了TKI耐葯后獲得性譜系可塑性以前被低估的程度，特別是在T790M?腫瘤中，與3Q擴增和非衰老突變簽名過程共存，潛在地促進了表皮生長因子受體獨立的信號機制。谷

鑒於檢查點抑製劑在EGFR突變的NSCLC中缺乏療效，我們試圖描述與EGFRTKI耐葯相關的免疫環境，最初根據“T細胞炎症基因表達譜”(GEP)特徵對腫瘤進行分層。

然後，我們使用了一種已發表的計算方法(TEDER；REF)進一步闡明與TKI耐葯相關的浸潤免疫細胞亞群。這表明，與免疫T790M+腫瘤相比，免疫T790M?中MDSCs的推測水平更高(P=0.04，t檢驗)，而TAMM2的水平更低(P=0.003，t檢驗)。免疫T790M?中PD-L1、FOXP3和IDO的表達也顯著高於免疫T790M+腫瘤(圖3B，PD-L1和FOXP3多重免疫熒光染色見附圖S15B和S15C)。接下來，我們調查了耐葯時的免疫表型是否與之前1G/2GTKI的持續時間有關。有趣的是，免疫T790M?腫瘤的總TTP最短(圖3C)，其中一半(5/10名患者

)的總TTP小於3個月。相反，免疫T790M+腫瘤的總生存期最長(中位TTP20.6個月；範圍8.2月至76.8月)，與免疫冷藏T790M+腫瘤相比(中位TTP4.1月；範圍1.3月至13月；心率11.78；P=0.004；95%CI3.01月~46.2月；P=0.001；圖3C)。Meta分析強調單劑免疫檢查點抑製劑在EGFR突變的非小細胞肺癌(59例)、7/8(88%，4/8熱、2/8冷、2/8未知)患者中缺乏療效，這與Meta分析一致(補充表S5)。然而，一名免疫T790M+患者(A096)在臨床試驗中接受了nivolumab-ipilimumab免疫檢查點抑製劑的聯合治療(60例)，並獲得了8.9個月的穩定病情。綜上所述，我們的數據提示炎性趨化因子的潛在作用，例如，CXCL9-可能由MDSCs驅動-在介導T790M?TKI耐葯中發揮作用。此外，我們的數據突出了GEP“熱”腫瘤中TME成分的顯著異質性，說明需要更詳細地詢問免疫環境以描繪特定的免疫靶點。

雖然第三代EGFRTKIs越來越多地被採用在一線環境中，但這種臨床實踐在一定程度上是由於無法預測單個患者的耐葯軌跡。在確定了與不同EGFRTKI抵抗狀態相關的新的分子特徵(3Q擴增、轉錄亞型、腺癌譜系標記丟失和炎症的TME)后，我們試圖建立一個模型來預測T790M的出現。我們推測，這些基因組、染色體水平和轉錄特徵可能存在於基線水平，也可能代表在治療過程中獲得的變化(圖4A)。為了進一步探討這一點，我們確定了在1G/2GTKI治療開始之前可能存在的三個軀幹特徵：EGFR外顯子19缺失、WGD缺失和TP53改變(圖4A)。使用貝葉斯方法，單個患者可以根據他們治療前的分子基因型被分成不同的組，其發生EGFRT790M耐葯的幾率非常不同(圖4B)。例如，在非WGD腫瘤中，發生T790M耐藥性的概率在87.2%到97.9%之間，這可能意味着序貫治療第一代/第二代到第三代EGFRTKI可能是這些患者(我們隊列中11%的患者)可行的臨床策略。這些特徵的預測能力需要在更大的隊列中進一步驗證。然而，這些結果說明了數據驅動的治療算法是如何通過真實世界的證據得出的，並可能有助於為個別患者定義最佳的排序策略。

我們的研究首次對EGFRTKI耐葯的基因組和轉錄圖譜進行了全面和綜合的分析。值得注意的是，我們的數據顯示，到目前為止，血統的可塑性在一定程度上被低估了。儘管在TKI耐葯後有1%到3%的患者有組織轉化的報道，但我們發現在T790M?腫瘤中，腺癌標誌物(napsin-A和tTF-1)普遍丟失，同時非tru亞型(PI和PP)明顯富集。雖然缺乏配對的基線樣本是我們研究的局限性，但與治療單純的EGFR突變的非小細胞肺癌的比較表明，腺癌譜系標誌的丟失，特別是在T790M?疾病中，可能代表了慢性EGFRTKI暴露導致的早期去分化事件。T790M?疾病更顯著的基因組改變有TP53突變(86%比50%)、3Q擴增(57%比13%)和MET改變(19%比3%)，這進一步導致了T790M?的可塑性和耐藥性。

臨床上特別感興趣的是T790M?隊列中的免疫熱亞群，它代表了一組患者的TTP明顯較短，其特徵是GEP評分高，PD-L1過度表達，以及富含趨化因子的免疫抑制微環境。與我們的發現一致，回顧性分析表明PD-L1的高表達與低應答率和PFS之間的關係，提示“炎症性”TME介導對EGFRTKI的原發性耐葯。最近，抑制EGFR信號被發現可以耗竭Treg和增加IFNγ信號，支持“炎性”的TME之間的聯繫，認為這是一種適應性變化，可能會削弱對靶向治療的反應。我們的數據進一步表明，炎性的TME可能發生在原發或繼發耐葯時，並由CD8+T細胞(腫瘤抗原特異性和/或旁觀者)、Treg和MDSC可變地組成。最後，觀察到IDO1的高表達，特別是在T790M?免疫熱腫瘤中，伴隨犬尿氨酸的過度表達(KYNU；圖2B)，暗示IDO途徑在維持Treg激活和在腫瘤亞群中的免疫抑制環境中起作用。最近，通過對一系列癌基因驅動的非小細胞肺癌腫瘤的單細胞RNA-SEQ，Maynard和他的同事同樣強調了IDO途徑、免疫微環境和肺泡再生細胞特徵在靶向治療中的重要性。我們的數據擴展了這些觀察，說明了治療誘導的適應性細胞

狀態可能會受到基因組改變的影響，並表明癌細胞、免疫細胞群和趨化因子中EGFR依賴性和譜系可塑性之間存在複雜的相互作用。為了更好地闡明這些免疫介質的作用，前瞻性研究正在進行中。免疫檢查點抑制，包括聯合抗PD-1和抗-4治療，在TKI耐葯環境下的臨床試驗中顯示明顯缺乏療效。除了正在努力評估腺苷軸的免疫抑制靶點，如腺苷2A受體(A2AR)、CD39和CD73，未來臨床試驗的合理靶點可能包括IDO、MDSC耗竭策略，如貝伐單抗或選擇性抑制PI3K-γ。